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皇帝坚决拒绝了它，1531年，新教诸侯组成了施马尔卡尔登联盟。
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1532年，查理五世承认了该联盟，并通过纽伦堡暂缓条约有效地暂停了《沃尔姆斯敕令》。
该条约要求新教徒继续参加对抗土耳其人和法国的帝国战争，并将宗教事务推迟到由教皇召集的大公会议解决。
由于教皇推迟组织大公会议，查理五世决定组织一次德国峰会，并于1541年主持了天主教徒与路德宗的雷根斯堡会议，但未能达成妥协。
1545年，特伦托会议终于召开，反宗教改革也由此开始。
该天主教倡议得到了神圣罗马帝国一些诸侯的支持。
然而，施马尔卡尔登联盟拒绝承认会议的合法性，并占领了天主教诸侯的领土。
因此，查理五世宣布施马尔卡尔登联盟为非法，并于1546年对其发动了战争。
次年，他的军队将联盟的军队驱逐出德国南部，并在缪尔贝格战役中击败了萨克森选侯约翰·腓特烈和黑森的菲利普，俘虏了两人。
在1548年的奥格斯堡临时和议中，查理提出了一项解决方案，允许新教徒享有一些特权，直到特伦托会议恢复统一。
然而，双方的成员都对这项临时协议表示不满，甚至有些人积极反对它。
1550年，大公会议重新召开，并有路德宗的参与。
查理五世将帝国宫廷设在奥地利的因斯布鲁克，以便他能够密切关注会议的进展。
1552年，新教诸侯联合法国国王亨利二世再次叛乱，第二次施马尔卡尔登战争爆发。
曾在第一次冲突中为帝国胜利立下战功的萨克森的毛里茨转而支持新教阵营，并绕过帝国军队，直接进军因斯布鲁克，企图俘虏皇帝。
查理五世在痛风发作时被迫逃离该市，勉强在半昏迷状态下乘坐担架逃到菲拉赫，并侥幸保命。
查理五世未能从法国手中夺回梅斯，随后他回到低地国家度过了他的最后几年皇帝生涯。
1555年，他指示他的弟弟斐迪南以他的名义签署奥格斯堡和约。
这一协议导致德国在宗教上分裂为天主教和新教的诸侯国。
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